转录组分析揭示了L-丙氨酸激活蛹虫草中虫草素网络的灵活性

虫草素是从传统药用虫草菌蛹虫草中分离得到的，因其具有多种临床功能而受到广泛关注。既往报道的添加L-丙氨酸可显著提高虫草素的产量，但其分子机制尚不清楚。华南农业大学林俊芳教授团队对添加L-丙氨酸诱导产生两倍虫草素的蛹虫草进行转录组分析，发现两个关键的Zn2Cys6型转录因子CmTf1和CmTf2通过编码基因的过表达，被证实具有使虫草素产量加倍的作用。转录数据揭示了虫草素合成中具有高灵活性的关键限速酶和转录因子，并绘制了蛹虫草中从底物氨基酸到产物虫草素的代谢网络图。

L-丙氨酸被证明对产生虫草素的效果最好（Kang et al.,2014）。为揭示虫草素的代谢途径，本研究以L-丙氨酸为诱导剂，提高蛹虫草中虫草素的产量。在液体静态培养基中培养30天后，虫草素的产量是未添加L-丙氨酸的虫草素产量的2.1倍（图1B）。此外，补充提出了变色和原基形成阶段。由于虫草素是一种无色核苷类似物，生长特性中的颜色差异可能是由于较高浓度的色素积累所致（图1A）。一般来说，原基是由一定数量的蛹虫草菌丝体聚集而成。菌丝生长速度的提高会积累更多的菌丝，使原基提前产生。蛹虫草早期原基的形成表明，L-丙氨酸可能通过提高菌丝生长速度来增加虫草素的产量。

图1.四个研究样本的特征。（A）培养30天后在玻璃瓶中的四个样品的生长特征。（B）每个玻璃罐中的虫草素产量。

为了弄清从添加的L-丙氨酸到虫草素的代谢途径，收集了四个样品并进行了转录组测序。利用蛹虫草参考数据库中的注释对转录数据进行了进一步的阐述，结果表明大约80%的基因在蛹虫草菌丝体期表达。将测序数据上传到GO和KEGG数据库。差异表达基因(DEGs)的GO分类结果表明，添加剂可以改善代谢过程，产生更多的代谢物，从而激活膜运输以避免虫草素难以负担的过量生产。KEGG分类显示大多数DEG与个体生长和代谢途径有关，这表明补充L-丙氨酸可能会影响特定的氨基酸代谢和能量代谢。KEGG注释结果和网络图，L-丙氨酸可以通过激活氨基酸互变来提高虫草素的产量。五个氨基酸（半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸和天冬氨酸）在相互转化中表现出明显的功能，并直接刺激组氨酸代谢的代谢物质转化，从而间接参与了虫草素的合成途径。KEGG途径ko01100的显著变化，表明添加L-丙氨酸增加了能量分子的产生并进一步促进了虫草素的生产。

图2.基因本体论和路径分析。（A）DEG的GO分类（x轴表示DEG的数量，y轴表示GO项）。（B）DEGs的富集。列的颜色表示校正后的P值：（高，黄色；低，橙色）或本体（蓝色，分子功能；粉红色，细胞成分；绿色，生物学过程）。（C）DEG的路径分类（x轴表示DEG的数量，y轴表示路径名称）。

Zn2Cys6型转录因子（TF）家族是蛹虫草子实体形成的重要组成部分。其中影响氨基酸代谢和虫草素产生的相关基因主要是CCM_02568和CCM_01481。在添加L-丙氨酸的情况下，这些基因在蛹虫草中过度表达，从而提高了虫草素的含量。

本研究中的转录组数据和先前报道的数据的结合揭示了蛹虫草发酵过程中L-丙氨酸添加对虫草素产生影响的可靠代谢网络图（图3）。L-丙氨酸的加入通过激活能量生成和氨基酸相互转化途径提高了虫草素的产量。在能量产生的生物途径中，激活的丙酮酸激酶和质膜H+-ATP酶直接增加ATP的积累，而Zn2Cys6 TFs（CCM_02568和CCM_01481）以一些未知的方式促进活性，产生更多的能量。额外消耗ATP可产生大量的ADP和AMP，它们是腺苷的前体。另一方面，L-丙氨酸参与了氨基酸的相互转化，大量的L-丙氨酸加速了氨基酸的形成。这些氨基酸通过组氨酸代谢，间接促进了腺苷前体IMP的积累。腺苷酸、肌苷酸及其中间产物（腺嘌呤、肌苷和腺苷酸琥珀酸）与腺苷反应的酶因腺苷酸和肌苷酸充足而处于活跃阶段，因此，过量的腺苷酸和能量增加了虫草素的产生。

图3.虫草中的虫草素代谢和生物合成途径。彩色显示的百分比表示该基因的转录水平高于样品中DEGs的多少基因（CMsI，蓝色；CMsII，橙色）的比率。虚线表示间接作用。实线箭头表示直接作用。

本研究揭示了虫草素合成中具有高灵活性的关键限速酶和转录因子，并绘制了蛹虫草中从底物氨基酸到产物虫草素的代谢网络图。对虫草素生成的关键节点有了清晰的认识，为今后提高虫草素产量和菌种选育提供了更好的基础。

原文发表于：Frontiers in Microbiology, 24 April 2020 https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00577 （翻译：菌物健康）